В конце ноября 1563 года с 80-тысячным войском Иван Грозный вышел из Москвы и 4 декабря прибыл в Можайск. Формирование русских полков завершилось в Великих Луках, всего было сформировано семь полков. А уже 9 января началось выдвижение московского войска к городу Полоцку. Через бежавшего предателя Хлизнев-Колычева в Полоцке узнали о приближении русского войска. Об этом сразу же было доложено гетману литовскому Н. Радзивиллу. Царь Иван Грозный предложил литовскому воеводе С. Довойне сдать город, но не получил ответа; более того, пленный, отпущенный в Полоцк с этим посланием, был казнен.

Осада города была завершена к концу августа 1563 года. Согласно плану наступление на город должны были вести из Задвинья по льду Западной Двины, так как окольный город – «Великий Острог» – не имел стен со стороны реки; поэтому в Задвинье расположились самые боеспособные части московской рати – Государев полк, Полк правой руки и Передовой полк. В начале осады завязалась перестрелка, носившая локальный характер. Однако 3 февраля на Западной Двине изменилась ледовая обстановка, и план осады пришлось изменить.

   

Государев полк передислоцировался в междуречье реки Полоты и Западной Двины для ведения наступления уже через укрепления Великого Острога. Тем временем на помощь Полоцку спешила армия Великого княжества Литовского во главе с гетманом Н. Я. Радзивиллом. Численность армии была 2500 – 3500 человек при 20 – 25 полевых орудиях. Так как армия была малочисленная, прямого сражения Радзивилл не планировал;  находясь на расстоянии не менее 8 км от города Полоцка, он занимался информационной войной, распуская слухи о многочисленности своего войска.

   

Русские отправили против этого отряда ратников с воеводами князем Ю. П. Репниным, А. И. Ярославовым и татарским «царевичем» Ибеком, при приближении которых Радзивилл поспешно отступил. Русские отряды вернулись обратно в Полоцк.

     

В начале февраля против городских стен начали сооружать осадные укрепления и устанавливать орудия; до этого московская артиллерия была расположена в основном у монастыря Святого Георгия в междуречье Полоты и Западной Двины. Первую попытку штурма предприняли московские войска: стрельцам И. Голохвастова удалось захватить башню над Западной Двиной, но они были выбиты оттуда. Параллельно со штурмом велся обстрел города, который длился до самой темноты. После этого осажденные пошли на переговоры, которые велись 5 – 8 февраля. Между тем на главных направлениях были расставлены туры. Из-за очевидной слабости полоцкого «наряда» московские пушкари в ночь с 5 на 6 февраля установили осадные орудия у самых стен города. К вечеру следующего дня к Полоцку подошел московский «большой наряд», и царь Иван Грозный потребовал от города капитуляции. В связи с тем, что кто-то из Полоцка выстрелил в царского посла, переговоры были сорваны. После этого начался обстрел города. Так как орудия были установлены практически вплотную к стенам Великого Острога, они просто разламывали их, пробивая насквозь. Между тем литовский воевода Довойна принял решение оставить полуразрушенный Великий Острог. Таким образом, город был подожжен и оставлен, а гарнизону, полоцким горожанам и боярам пришлось отступить в Полоцкий замок, при этом до 12 тыс. полочан попало в плен. Начался большой пожар, московские войска на плечах осажденных пытались ворваться в замок, завязался упорный бой. В разгар боя русские пушки «большого наряда» – «Кортуна», «Орел», «Медведь» – были установлены напротив Полоцкой крепости на пожарище Великого Острога, в Задвинье и Заполотье. 

13 – 14 февраля орудия били без перерыва целые сутки. Ночью защитники крепости предприняли неудачную вылазку всеми силами с целью уничтожения московской артиллерии, но безуспешно. За несколько часов до рассвета 15 февраля московские войска начали подготовку к генеральному штурму, положение защитников стало безнадежным. Из города вышел полоцкий епископ Арсений (через него литовский воевода Довойна просил о переговорах), но царь Иван Грозный потребовал прибытия для этого самого Довойны. Полоцк был сдан после трехдневной осады 15 февраля 1563 года.

   

В осаде Полоцка, событии мирового масштаба того времени, погибли 86 русских людей: 4 детей, 66 стрельцов, 15 «боярских людей» и «голова казатская».

   

28 февраля, оставив в Полоцке гарнизон и отдав распоряжения об укреплении города, царь Иван IV (Грозный) с основными силами вышел к Москве. Часть пленных полоцких бояр была обменена на московских пленных или выкуплена Великим княжеством Литовским. Так, в 1566 году Довойна был обменян на московского «сына боярского». Епископ Арсений был сослан в Спасо-Каменный монастырь.

   

События полоцкой осады вызвали международный резонанс: в Аугсбурге, Любеке, Нюрнберге, Праге и других городах Европы вышли информационные листовки, посвященные событиям в Полоцке.

     

В Великом княжестве Литовском и Польском королевстве были поражены полоцким взятием. Сейм в Петрокове был прекращен, а литовский Великий князь Сигизмунд Август срочно сообщил о своем возвращении в Великое княжество Литовское для организации обороны, приказав не вступать в бой с московскими войсками, а приложить все силы для защиты Вильно.

     

Взятие Полоцка было максимальным успехом Московского государства в Ливонской войне, хотя и позднее московские войска одерживали победы в Ливонии. Кризисное положение, в котором после потери Полоцка оказалось Великое княжество Литовское, фактически заставило его слиться с Польшей.